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新一代调节性T细胞疗法:CAR-Treg

时间:2022-10-09 16:16:14 来源:

前言

调节性T细胞(Treg)是免疫细胞的一小部分,专门用于抑制过度免疫激活和维持免疫稳态。在过去二十年中,嵌合抗原受体(CAR)的开发和基因组编辑的进展促进了T细胞治疗的优化, 这些技术现在被用于增强Treg细胞的特异性和功能性, 以Treg细胞为基础的自身免疫和移植治疗正得到快速的发展。

Treg的分类和功能

Treg是T细胞的一个子集, 占CD4+T细胞总数的5-10%,具有维持体内平衡和预防自身免疫的功能,其特征是CD4、CD25、FOXP3和低水平CD127的共同表达。高水平的FOXP3和特异性去甲基化区域(TSDR)的去甲基化是Treg的显著特征,TSDR是FOXP3基因中的一个保守区域。

Tregs可分为两类:天然调节性T细胞(nTregs)和诱导调节性T细胞(iTregs)。两种类型的Tregs都普遍表达 Foxp3。nTregs在胸腺中自然发育,其抑制作用是通过细胞间接触实现的,它们的主要功能是维持正常的免疫耐受和控制炎症反应。

iTregs来源于肿瘤微环境信号诱导的外周原始T细胞,包括肿瘤抗原、细胞因子(如IL-10,TGF-β)和其他可溶性分子。iTregs通过多种促进肿瘤进展的机制抑制效应T细胞(Teff)、NK细胞和DC的抗肿瘤免疫作用。

Tregs主要有以下五种功能机制:①Tregs分泌抑制性细胞因子,包括 IL-10、TGF-β 和 IL-35。②Tregs 通过颗粒酶和穿孔素杀死效应细胞。③ Tregs 影响效应细胞的功能:Treg 与效应T细胞竞争消耗 IL-2,从而抑制效应T细胞的生长;Tregs通过产生胞外酶CD39和CD73 促进TME中腺苷的产生,诱效应细胞导的抑制和抗增殖作用;Tregs通过缝隙连接将大量 cAMP 转移到效应T细胞,干扰其代谢。④Tregs通过刺激性和抑制性受体(CTLA-4 或 LAG3)诱导DC耐受,后者通过IDO进一步抑制T细胞的能力。⑤MDSCs和Tregs 产生的因子形成正反馈环,促进增殖,增强抑制环境。

此外,一项研究使用一种新的策略来定义Tregs, Th1样Tregs(T- 234bet+IFNγ+Foxp3+),Th2 样Tregs(Gata3+IRF4+IL4+Foxp3+)和Th17样Tregs(IL-17+RORγt+Foxp3+),这为靶向 Tregs 治疗提供了新思路。

过继性Treg:从多克隆到抗原特异性

最初过继性Treg的临床试验主要使用多克隆或体外扩增的Tregs。第一份关于用体外扩增的Treg治疗GVHD的报告表明,慢性GVHD患者的症状得到缓解,并有可能减少免疫抑制剂的使用。几年后,11名接受干细胞移植治疗恶性血液病的GVHD患者获得了脐带血来源的Treg,并进行了扩增和给药。接受Treg治疗的患者II-IV级急性GVHD的发病率降低5倍,Treg治疗组一年后无慢性GVHD,而对照组为14%。

虽然多克隆Tregs获得了一定程度令人鼓舞的效果,但是输注所需的细胞数量相当大,此外,还有非特异性免疫抑制的风险,事实上,多克隆Tregs输注后的病毒再激活已有报道。

这些缺点可以通过使用抗原特异性Treg来克服,与多克隆Treg相比,抗原特异性Treg只需要较少的细胞就可以实施更多的局部和靶向抑制。此外,许多研究已经证明,在动物模型中,特异于所需抗原的Treg在功能上优于多克隆或未修饰的Treg。

传统的产生抗原特异性Treg的方法主要依赖于用APCs和特异性抗原扩增,或用T细胞受体(TCRs)工程化的Treg。然而,用APCs扩增Treg效率低下,而用TCR构建的Tregs(TCR-Tregs)仍然受到MHC的限制,限制了针对不同患者的模块化应用。

CAR-Treg的设计

另一种赋予Tregs特异性的方法是用CAR转导这些细胞。与TCR-Treg相比,CAR具有一些独特的优势:这些表达CARs的T细胞激活时绕过HLA限制,通过共受体信号的激活增加了特异性,以及CARs的靶向灵活性(任何可溶性或表面多价抗原都可以作为靶点)。

CAR-Treg细胞最直接的应用是GvHD和器官移植排斥反应。与大多数自身免疫性疾病不同,移植中有非常明确的靶点,即HLA分子。2016年,首次报道了HLA-A2CAR Treg细胞,研究证明,HLA-A2-CAR-Treg细胞抑制Teff细胞增殖,并在免疫缺陷NSG小鼠模型中阻止了HLA-A2+PBMC介导的GvHD。

CAR-Treg细胞的新应用仍在出现,B细胞靶向抗体受体(BAR)Treg细胞是近年来研究的热点。人VIII因子(FVIII)注射液用于治疗A型血友病患者,而随着时间的推移,抗FVIII中和抗体的发展会导致发病率和死亡率上升。含有FVIII免疫显性结构域(A2或C2)作为胞外结构域的BAR被设计成靶向FVIII特异性B细胞,细胞内信号结构域仍为CD28-CD3ζ。引人注目的是,在体外,展示A2结构域或C2结构域的人BAR-Treg细胞抑制了用重组FVIII免疫的小鼠产生抗FVIII抗体。

CAR-Treg设计的另一个重要方面是共刺激领域的选择。目前使用的共刺激域与传统CAR-T细胞中使用的相同。虽然传统T细胞和Treg通常表达相同的共刺激受体,但细胞内的信号不同,导致不同的效应器功能。

到目前为止,大多数CAR-Treg的共刺激域是4-1BB或CD28。最近,人们研究了具有10个不同共刺激结构域(例如CD28、CD28Y173F、ICOS、CTLA-4、CTLA-4 Y165G、PD-1、4-1BB、GITR、OX40、TNFR2)的第二代CAR-Treg,当测试功能和基因表达谱时,表明CD28共刺激信号传递更优越。使用4-1BB或TNFR2会导致Treg稳定性和功能下降。

CAR-Treg在自身免疫疾病的研究进展

GvHD

Treg治疗已成为GvHD研究的一个重要领域,大多数研究集中于体外扩增的多克隆Treg。治疗GvHD的Tregs的首次临床试验显示,对急性GvHD症状的影响不大,但显著缓解了慢性GvHD的症状,并减少了免疫抑制剂的使用。

随后的研究开始使用CAR-Tregs,这是一种同种抗原特异性人类Tregs,被设计用于表达HLA-A2-特异性CAR。在体外和体内试验中,这些A2-CAR Treg保持FoxP3、CD25、Helios和CTLA-4的高表达。此外,他们在免疫缺陷小鼠模型中预防了异种GvHD。

继HLA-A2靶向CAR-Tregs成功后,最近的研究重点是产生具有不同靶向结构域的CAR-Tregs,如CD83,其可在小鼠模型中预防GvHD。还有CD19,其可抑制B细胞抗体的产生和导致GvHD的病理学。

这些有希望的结果促成了在英国和美国对肾移植患者进行的第一次CAR-Treg临床试验(NCT04817774)授权。这项试验可能支持CAR-Tregs在临床试验中优于多克隆扩增的Tregs,进一步扩大了在其他疾病条件下使用CAR-Tregs的可能性。其他生物制药公司紧随其后,例如Quell Therapeutics,专注于肝移植受者的CAR-Tregs。

糖尿病

1型糖尿病(T1D)是一种自身免疫性疾病,其特征是由于胰腺β细胞的破坏而导致胰岛素缺乏。研究表明,T1D患者中Treg的免疫抑制功能降低。在动物模型中,输注扩增的抗原特异性Treg在阻断和逆转糖尿病方面显示出有希望的结果。然而,由于在循环中罕见,分离足够多的抗原特异性Treg具有挑战性。

因此,研究重点是用FoxP3基因转导的多克隆CD4+T细胞,将其转化为Treg。此外,可通过工程化TCR或CAR技术将抗原特异性赋予多克隆T细胞。Brusko的研究小组发现,谷氨酸脱羧酶(GAD)特异性TCR转导的Treg在体外可以抑制抗原特异性T细胞增殖的能力。另一项研究中,Hull等人将胰岛特异性TCR转移到调节性T细胞,并证实其在体外具有抑制CD4和CD8 T细胞增殖的能力。目前,GentiBio和Abata等公司正在开发TCR工程化Treg治疗T1D。

类风湿性关节炎

类风湿性关节炎(RA)是最常见的炎性关节炎,其特征是滑膜炎症、增生、自身抗体产生、软骨和骨破坏。多种免疫细胞亚群参与RA的发展,其中,T细胞和巨噬细胞之间的相互作用起着至关重要的作用。

许多研究调查了增加Treg数量或改善Treg功能对RA的益处。Wright等人利用卵清蛋白(OVA)特异性Treg,通过产生TCR转导的Treg或TCR-FoxP3转导的CD4+T细胞,来抑制OVA诱导的关节炎。两种工程化Treg均通过旁观者抑制对不同抗原特异性T细胞的增殖表现出OVA依赖性的抑制。目前,Sonoma Biotherapeutics公司正在开发针对RA的CAR Treg疗法。

多发性硬化症

多发性硬化(MS)是一种自身免疫性脱髓鞘和神经退行性疾病,由识别髓鞘表位的自身反应性T细胞引起。使用实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型进行的临床前研究证实了Tregs抑制抗原特异性自身反应性免疫反应的有效性。

Fransson等人用CAR靶向髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)创建抗原特异性Treg。MOG-CARTregs在体外抑制了效应T细胞的增殖。在体内,MOG-CARTregs减少了EAE小鼠的疾病症状,并减少了脑组织中的促炎细胞因子mRNA水平。后来,Kim等人利用源自MS患者的髓鞘碱性蛋白特异性TCR构建了Treg,在体内TCR-Tregs显著降低了EAE-MS小鼠模型中的疾病评分。免疫调节工程化Treg在临床前研究中的结果,促进了一些生物制药公司的CAR-Treg的开发,如Abata Therapeutics和TeraImmune。

炎症性肠病

炎症性肠病(IBD)是以胃肠道慢性炎症为特征的疾病,溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)是IBD最常见的形式。研究表明,肠道微生物群和免疫反应之间的不平衡在IBD中起着重要作用。通常,肠道炎症与Treg数量的减少无关。然而,Treg活性不足的小鼠更容易发生严重结肠炎。因此,多项研究试图利用Treg抑制活性来维持UC的耐受性。

在一项研究中,来自转基因小鼠的针对已知结肠炎抗原(TNP)的CAR-Tregs在体外抑制了效应T细胞的增殖。在体内,诱导结肠炎后,与野生型动物相比,观察到CAR-Treg转基因小鼠的存活率增加。此外,将TNP-CAR Tregs转移到结肠炎小鼠模型中可以减少症状并提高存活率。基于CAR-Treg细胞的治疗可能是缓解UC和CD的一种有前途的有效方式。

哮喘

哮喘是一种慢性呼吸道疾病,哮喘患者的Treg受损并减少。因此,新方法专注于通过在哮喘临床前模型中转移调节性T细胞来预防气道炎症。此外,一项研究利用调节T细胞表位(Tregitopes)诱导高度抑制性过敏原特异性Treg。

用Tregitopes治疗可抑制过敏原诱导的气道高反应性和肺部炎症。为了将Treg导向哮喘相关抗原,Skuljec等人应用CAR技术,从转基因小鼠中分离出针对CEA的第二代Treg,CEA是一种存在于肺和胃肠道腺上皮表面的糖蛋白。他们的结果显示了哮喘小鼠炎症肺中CEA-CAR Tregs的激活和归巢。此外,与未修饰的Tregs相比,CEA-CAR Tregs在更大程度上改善了炎症。

下一代工程化Treg

合成生物学

开发Treg细胞作为治疗自身免疫性疾病的药物并不仅局限于TCRs和CARs的应用,合成免疫学已经产生了许多人工受体和系统,正在Treg细胞中进行测试。

这些系统包括通过连接的单链抗体将内源性TCR复合物招募到非MHC靶点的T细胞抗原偶联剂,可以被可溶性配体结合并激活的CARs,以及可分开的、通用和可编程的CAR(SUPRA)。

细胞因子

毫无疑问,细胞因子在免疫反应中起着关键作用。Treg细胞组成性地表达IL-2受体的高亲和链CD25,有效地剥夺Teff细胞的IL-2。此外,通过工程化CAR-Treg细胞的改造,可以将促炎细胞因子信号转化为IL-2或IL-10信号以增加对炎症的抑制。

基因编辑一些利用CRISPR–Cas9编辑人类T细胞基因的临床前研究已有发表,这些包括敲除CD4+T细胞中CCR5的基因,产生抗HIV感染的T细胞;敲除CD7-CAR T细胞中CD7的基因,因为T细胞本身表达CD7,从而防止自相残杀;以及敲除CD19-CAR T细胞中PD1的基因,从而提高人源化小鼠模型的肿瘤清除率。提升递送系统

目前,CAR T细胞的制造使用逆转录病毒和慢病毒转导将遗传物质传递并整合到T细胞中。然而这些方法费时、昂贵且有安全问题的困扰。

一些非病毒的递送方法正在开发中,例如CRISPR-RNPs共电转,可以将超过1 kb的DNA敲入人T细胞的特定基因组位点,这种方法简单,安全,双链DNA模板没有毒性。利用该方法纠正了单基因自身免疫性疾病患者细胞中的致病性CD25突变,证明了其潜在的应用价值,但是这种方法也受到插入片段大小的限制。

设计Treg细胞

Treg细胞治疗面临的一个障碍是确保细胞在输注后的存活,利用基因编辑敲除Treg细胞中JNK1基因可使其抗凋亡,JNK1缺陷的Treg细胞分泌更高水平的IL-10和TGFβ ,可以保护移植胰岛不受排斥反应的影响比对照延长100天。

此外,Treg细胞在炎症环境中也可能变得不稳定,并转化为致病性TH17细胞。通过敲除PRKCQ基因,可以降低了Treg细胞向TH17细胞分化的倾向,同时保持了Treg细胞的抑制功能。

最后,通过基因编辑获得最新一代低免疫原性人多能干细胞,再加上不断的努力将干细胞分化为Treg细胞,这可能会彻底改变工程化Treg细胞治疗的手段。

小结

目前,利用Treg细胞设计治疗自身免疫疾病正方兴未艾,工程化CAR-Treg在这方面表现出独特的优势,具有极大的潜力。然而,在Treg细胞生物学和Treg细胞治疗领域仍存在许多问题。

在接下来的十年中,随着这些悬而未决的问题的解决,期待看到Treg细胞制造的持续改进,以及与合成生物学和基因编辑的广泛应用,将使Treg细胞疗法发挥出越来越重要的作用。

参考文献:

1. The Future of Regulatory T Cell Therapy: Promises and Challenges of Implementing CARTechnology. Front Immunol. 2020; 11: 1608.

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5. CAR-T Regulatory (CAR-Treg) Cells:Engineering and Applications. Biomedicines. 2022 Feb;10(2): 287.

原文标题:新一代调节性T细胞疗法:CAR-Treg


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